白腐真菌产酶反应器研究进展

　　白腐真菌酶系具有独特的降解机理,对包括木质素、多环芳烃、氯代芳烃、染料、炸药、农药等多种难降解有机污染物有很强的降解能力[ 1, 2 ] ,这种特殊的降解机制展现了巨大的潜在应用前景,引起了学术界和工业界的极大兴趣[ 3 ] 。自从Tien等[ 4 ]和Glenn 等[ 5 ] 同时发现白腐真菌黄孢原毛平革菌( Phanerochaete chrysosporium )对木质素降解的关键是其产生的胞外过氧化物酶系的作用后,人们对该菌比较重要的3 种酶即木质素过氧化物酶( ligninperoxidase,简称L iP) ,锰过氧化物酶(Mn2dependentperoxidase,简称MnP)和漆酶(Laccase)进行了广泛研究。黄孢原毛平革菌对异生物质的降解主要依赖于由该菌细胞分泌的胞外酶进行,需氧并启动一系列的自由基链反应,实现对底物的无特异性的氧化分解[ 6 ] 。细胞外的非专一性的降解体系,使污染物不必进入细胞,从而使该菌对不溶的、有毒的、结构各异的物质均有作用能力。另一方面,这种关键酶胞外工作的特点要求除了必须满足菌体需要的营养限制(限碳或限氮) 、足够的供氧等环境条件外,还要避免其胞外酶的结构及活性遭受剪切力等因素的破坏。因此,所用反应器的结构和运行参数对其产酶至关重要。本文就白腐真菌的培养方式与条件、反应器的选择等方面较为系统地阐述了反应器对其产酶的影响。

　　1木质素降解酶系的酶活性定义及测定方法

　　1. 1　酶活性定义

　　酶是生物催化剂,所以酶活性(也称酶活力)的大小常用它催化某一种特定反应的能力来表示。酶活性的大小,也就是酶量的多少,用酶的活力单位( active unit,简称U)来度量。1961年国际生物化学学会( IUB)酶学会议规定: 1个酶活力单位,是指在特定条件下,在1 min内能转化1μmol底物的酶量,或是转化底物中1μmol的有关基团的酶量。酶的比活性( specific activity)也称为比活力,是指每毫克蛋白所具有的酶活力单位数。比活力是表示酶制剂纯度的一个重要指标。对同一种酶来说,酶的比活力越高,纯度越高。

　　1. 2　测定方法

　　木质素降解酶系的酶活性测定常用分光光度法,此方法不需要昂贵的仪器,操作简便快捷,对实验条件的要求也不是太高,因此应用较为普遍。酶标仪原理与分光光度计相同,但它可同时测定多个样品并实现了进样读数的自动化,特别是与计算机联用后,使酶活性的测定过程更为简单快捷,准确可靠。在缓冲环境下,L iP活性测定体系中,以藜芦醇为底物;MnP活力测定体系中,常以Mn2 +为底物,添加H2O2 启动反应; Laccase活力测定体系中,常以ABTS为底物,测定酶对其的氧化速度。

　　2　培养方式与条件

　　2. 1　培养方式

　　在白腐真菌产酶的培养方式上,研究最多的是液体培养,采用振荡培养的情况比静置培养的多,采用深层培养比浅层培养的多。近年来固体培养的报道越来越多。付时雨等[ 7 ]发现:固体培养条件下贝壳状革耳菌产生的漆酶活性远大于它在液体培养条件下产生的酶活性,而且对同功酶的产生有较大的影响。固态培养具有操作简便、成本低廉、产酶率高、耗能低等优点,更重要的是它的产酶条件更接近于自然条件下白腐真菌的生长状态,更适于工业化大规模产酶。Couto等[ 8 ]研究了在固态条件下培养白腐真菌连续操作产酶时发现:该操作有效避免了菌丝的过度生长、菌丝周围多糖和使酶失活物质如蛋白酶等的生成等。MnP酶活性在第11 d达到峰值180 U /L,平均酶活性为75 U /L;而LiP酶活性同样在第11 d达到峰值313 U /L,平均值为Carvalhoc等[ 9 ]在填充床中以半连续操作方式获得酶活的11倍。

　　2. 2　营养条件

　　常用的培养基主要包含碳氮源、缓冲液、微量元素、生长因子等。因黄孢原毛平革菌的降解功能主要发生在次级代谢阶段,与降解有关的酶只有当一些主要营养物(如氮、碳)受到限制时才能合成。营养限制使黄孢原毛平革菌应答产生了对底物的降解酶系统。李越中等[ 10 ]发现:糊精是最优碳源,混合糖源比单独糖源好。在氮源中,酵母浸汁和牛肉膏培养物中木质素过氧化物酶活性最高,低碳高氮培养基有利于酶的合成。 Dosoretz等[ 11 ]考察了通氧和通空气对2种过氧化物酶合成的影响,发现空气条件下菌丝不合成木质素过氧化物酶,能合成锰过氧化物酶但低于通氧时产生的酶活性。而柯世省等 [ 12 ]的研究结果表明,空气环境下限碳培养黄孢原毛平革菌,合成的木质素过氧化物酶最高酶活性可达360 U /L,比通纯氧条件下限碳培养时的木质素过氧化物酶活性要高160%。这可能是由于过量地通氧增加了葡萄糖的消耗,产生较多的蛋白酶和多糖,从而抑制了酶活性,酶活性越过峰值后下降也越快。由此可见,在提高酶活性方面,有些结果是看似相互矛盾,需要具体情况具体分析。Dosoretz等[ 11 ]的研究结果表明:在限氮培养时生长阶段和次级代谢阶段分别生成初级蛋白酶和次级蛋白酶,它们对木质素过氧化物酶有破坏作用。为提高合成酶的能力,可以采用流加葡萄糖或加入蛋白酶抑制剂来减小这种作用。在限碳培养条件下, Kirk等[ 13 ]发现缓冲液以邻苯二甲酸对产酶最有利,培养的最佳pH是415。Fenn 等[ 14 ] 认为二甲基琥珀酸缓冲液(DMS)是较好的缓冲液, DMS是目前最常用的缓冲液。Kirk等[ 13 ]研究了添加藜芦醇和微量元素对合成木质素过氧化物酶的影响,发现添加一定量的这两种成分,不仅显著提高了酶活性,而且酶活性的总量也有增加。他们还证明了维生素B1 是菌丝生长和产生木质素降解酶系所必需的唯一维生素。Jager等[ 15 ]报道在静置培养中黄孢原毛平革菌可以合成木质素过氧化物酶,但在摇瓶培养中只有加入吐温等表面活性剂才能合成,并且通过添加表面活性剂span280 (0. 05% )成功地解除了振荡培养对产酶的抑制(转速为200 r/min) ,从而为生物反应器的研究开辟了道路。吐温80的最佳浓度是0. 05% ～0. 1% ,此浓度下它不仅增加了细胞膜的通透性,解除了已合成的酶在胞内的积累所产生的抑制作用,而且还有一定的生理作用。Asther等[ 16 ]研究了温度对木质素过氧化物酶合成的影响时发现:一般来说对数生长结束后降低温度有利于次级代谢物的启动,因此为提高产酶量可以把培养温度分为2个阶段来控制:第一阶段是生长阶段,第二阶段是木质素过氧化物酶系合成阶段。控制生长温度为37 ℃、酶合成期温度为30 ℃培养所得的最高酶活与温度恒定在37 ℃培养相比,要高1倍多。综上所述,白腐真菌产酶的培养方式多为液体培养,常采用限碳或限氮培养基,加入维生素和表面活性剂,通入空气或氧气等措施来强化产酶。然而即使同一菌种,在不同反应器中的最佳产酶条件也不尽相同。目前的研究也都还集中在实验室的中小型反应器阶段,这些都为白腐真菌酶系的大规模生产及应用带来一定困难。

　　3　细胞的生长方式

　　近年来,采用固定化细胞培养合成木质素降解酶系已经引起了广泛的重视,和游离细胞培养相比,它能更有效地合成木质素降解酶系。至今,已报道过多种载体对黄孢原毛平革菌的固定,其中用尼龙网、聚丙烯、烧结玻璃、多孔陶瓷、不锈钢、硅管、琼脂糖、琼胶颗粒和聚(苯乙烯2二乙烯基苯)均取得了较好的效果。菌丝固定化后,稳定性增强并且可以很方便地重复利用来合成木质素降解酶。很可能是不与流体直接接触的内层菌体免受剪切力的影响,酶的高级结构和活性中心不易被破坏,也就提高了酶活性。张朝晖[ 17 ]对限氮培养基在纯氧环境下培养黄孢原毛平革菌合成木质素过氧化物酶的条件进行了研究,在摇瓶培养中,较大的菌丝球和较小的通氧强度将延迟酶的合成。在 175 r/min的转速下,用聚氨酯泡沫固定化培养,木质素过氧化物酶的最高酶活性比游离菌丝球培养时提高1倍。Ruckenstein等[ 18 ]用多孔聚合物固定黄孢原毛平革菌,在限碳时培养合成木质素过氧化物酶(聚合颗粒形状为边长0. 4 cm的立方状,比表面积224 m2 /g)时发现,培养至第6 d得到最大酶活性为602 U /L,比游离培养所得酶活性( 307 U /L)高1倍,并且达到最大酶活性时间也比游离培养提前了8 d。固定化颗粒6周内重复使用了16批,最高酶活性737 U /L,第16批的酶活仍达到594 U /L。L inko[ 19 ]在8 L 的发酵罐中用聚氨酯泡沫固定黄孢原毛平革菌,产酶期通55%～70%的氧气,最高酶活性可达550 U /L。为了更好地与空气接触, Feijoo等[ 20 ]设计聚氨酯泡沫块半悬浮、半浸没在培养基中进行摇瓶培养,在限碳条件下,最高酶活为300 U /L。上述培养,聚氨酯泡沫的用量都很大( 20 g/L 培养基) 。Kirkpatrick等[ 21 ]用少量的聚氨酯泡沫来固定,最高酶活只有100 U /L。Nakamura等[ 22 ]以聚氨酯泡沫为载体固定菌体,在限氮条件下合成木质素降解酶系, L iP、MnP和Lac2case的酶活峰值分别高达450 000、370 000 和100 000 U /L。由此可见,通过适当载体对菌体进行固定,可显著提高产酶效率。

　　4　不同反应器的特点及应用

　　反应器的构型设计和参数确定是关键,也是国内外研究的热点。合成酶所用的生物反应器应该满足如下基本要求:反应器内流体混和均匀、剪切力适宜;为了给细胞生长和目标产物酶的合成提供最佳的环境条件,需要能够对反应器中的pH、温度、溶解氧、氧化还原势、搅拌转速等参数进行测量和控制;必须防止杂菌污染,维持纯种培养等[ 23 ] 。

　　4. 1　机械搅拌式反应器

　　机械搅拌式反应器是最常用的反应器,它能适用于大多数的生物培养过程,已经形成标准化的通用设备。只有在它的气2液传递性质或剪切力不能满足生物过程时才会考虑选用其他类型的反应器[ 24 ] 。为了防止搅拌时液体产生涡流,可在反应器内侧安装挡板, 以增强液体的径向混合。L inko等[ 19 ]在10 L的发酵罐中,把黄孢原毛平革菌固定在尼龙网上,以限碳培养方式合成木质素过氧化物酶。为提高产量,根据富氧环境对产酶有利的特点,他们在生长期通空气,而在产酶期通纯氧(氧分压维持在50%～70%) 。第3 d出现酶活性后,多次加入l g/L的葡萄糖刺激酶活性的增加,最高酶活性为730 U /L。Venkatadri等[ 25 ]在普通的发酵罐中插入缠绕着聚硅氧塑料管的不锈钢管,在管内通氧给生长在塑料管表面的菌丝供氧,最高酶活性达到203 U /L,可连续重复产酶5周以上。Couto等[ 8 ]在发酵罐中实现了固体培养,他们采用间歇式操作时,L iP酶活性均值高达24618 U /L, Laccase 均值为6815 U /L;当进行30 d的连续培养时,MnP酶活性均值为150 U /L, Laccase 酶活性均值可高达330U /L。

　　4. 2　固定床

　　固定床反应器的基本原理是反应液连续流动通过静止不动的固定化菌体(或生物催化剂) 。固定化的主要优点是可以重复利用菌体细胞,便于将菌体细胞与反应产物分离[ 26, 27 ] 。Shim等[ 28 ]把生长培养基和诱导培养基交替通入到8 L的固定床反应器中,间歇培养合成木质素过氧化物酶,最高酶活性为8100 U /L。Mielgo等[ 29 ]以2, 62二甲氧基苯酚为底物,在固定床生物反应器中半固体培养黄孢原毛平革菌,最大MnP酶活性达1293 U /L, L iP酶活性最大为225 U /L。Couto等[ 30 ]在填充有尼龙海绵的管式固定床反应器中,以半固态条件操作进行了2批培养,第一批中,葡萄糖消耗速率为0157 g/L·d,氨氮在第4 d消耗完,MnP在第3 d开始出现,酶活性为76 U /L,第7 d达到峰值为1293 U /L; LiP在第2 d开始出现,酶活性16 U /L,第8 d达到峰值为225 U /L;而Laccase的合成不规则,最大值为33 U /L。在第二批操作中,葡萄糖的消耗速率为0133 g/L·d,此时MnP在第2 d出现为45 U /L,第6 d达到峰值956 U /L,比第一批低了35%;而LiP在第2 d出现为20 U /L,第5 d达到峰值165 U /L,比第一批略微下降; Laccase更不规则,峰值达到58 U /L。这也说明了营养调控的重要性。固定床反应器常用于连续生产,反应器可连续运行20多d, Feijoo等[ 31 ]认为平推流和完全混合都不利于固定床产酶,产酶的最佳回流比是2∶1。

　　4. 3　滴流床

　　填充床适合于固定化微生物细胞连续产酶过程。一般从上端流出含较高浓度产品的反应液,这种情况下,单位体积反应器内固定化颗粒的装置量比流化床大得多。但由于固定化细胞长期静止地堆积在一起,随着细胞的不断生长,容易造成营养供应不良。对于好氧发酵,也可以有限度地向填充床通气,这时一般称为滴流床。但由于固定化细胞装填过密以及必须避免产生流化,通气量受到严格的限制[ 32 ] 。Ruggeri等[ 33 ]利用滴流床生物反应器间歇培养黄孢原毛平革菌,反应器内散堆鞍形填料(填料表面经处理形成一层海藻酸钙薄膜) ,膜内固定菌体,培养基循环利用,在第10 d木素过氧化物酶活性达1220 U /L。

　　4. 4　转鼓式反应器

　　转鼓式生物反应器通常是通过转盘或转鼓的旋转达到混合的目的,其混合程度一般,取决于发酵的要求。通常是用较低的旋转速度(1～15 r /min) ,高速旋转混合的应用很少。原因是高旋转速度会损伤菌丝体,而且能过多的产生热量,影响微生物产酶和其他次级代谢产物。转鼓式反应器的转鼓直径不宜过长、体积不宜过大,否则不仅操作困难,而且在旋转过程中会导致培养基结成球状,从而影响微生物对营养物的利用。除机械搅拌式反应器以外的其他类型反应器中,转盘反应器最早合成木质素降解酶:在2. 5 L的反应器中(转速为1 r/min) ,得到最大木质素过氧化物酶活性为30 U /L[ 34 ] 。Dominguez等[ 35 ]采用转鼓式生物反应器半浸没培养黄孢原毛平革菌,以尼龙海绵为载体,菌丝固定在尼龙海绵体上,采用间歇式培养, 通气量分别为0. 5 L /L· min (升通气量/升培养基·分钟)和1 L /L · min时进行试验。结果表明:在通气量为1 L /L· min时酶活性是015L /L·min时的3倍,MnP在第11 d峰值达1350 U/L,LiP在第6 d峰值达364 U /L。而且在此操作下还出现了Laccase,在第3 d出现峰值为56 U /L。

　　4. 5　鼓泡塔

　　鼓泡塔的主体是一个容器,通常呈圆柱形,高度和直径之比通常为4～6。在容器底部通过多孔管、多孔盘、烧结玻璃、烧结金属或者微孔喷雾器向反应液通气。为了加强混合,还可以在容器内安装一系列水平的多孔板、垂直的隔板等。鼓泡塔的优点是不需要机械传动设备、动力消耗小、不易污染菌种;缺点是不能提供足够高的剪切力,传质效率低,丝状菌有时会形成很大的菌丝团而影响代谢和产物合成。张朝晖等[ 36 ]以聚氨酯泡沫塑料为固定化载体,在三相鼓泡塔反应器中培养黄孢原毛平革菌,可以高效地合成木质素降解酶系。实验表明,合成木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶的最佳通气量均是1. 0 L /L· min。在此通气量下,最大木质素过氧化物酶的酶活性达367 U /L,最大锰过氧化物酶的酶活性达4720 U /L。在培养基相同和单位体积载体用量相同的条件下,与摇瓶培养相比,酶活性分别增大1倍和1. 2倍。这是因为在摇瓶培养中,气液间的传质只在液相表面进行,而在三相鼓泡塔中,通过分布器进入液相主体的气体已经分散成许多微小的气泡,大大增加了气液相界面积,强化了传质,气泡间的扰动也大大促进了三相间的物质传递,培养液所受的剪切力比摇瓶小得多。一定条件下,在三相鼓泡塔中可以进行重复间歇培养生产木质素过氧化物酶,连续进行了5批培养,每批木质素过氧化物酶的最大酶活性均在250 U /L以上,最高酶活性出现在第二批为480 U /L,总培养时间达22 d。

　　4. 6　气升式反应器

　　气升式反应器是应用最为广泛的生物反应器,是在鼓泡塔的基础上发展起来的。它利用空气的喷射功能和流体密度差造成反应液循环流动,来实现液体的搅拌、混合和氧传递。即不用机械搅拌(避免了菌丝的缠绕附着) ,完全依靠气体的带升使液体产生循环发生湍动,从而达到气液混合和传递的目的[ 37 ] 。它的容器被一个隔板或导流管分割成相通的2个区域,其中只有一个区域通气。通气的区域称为上行区,不通气的区域为下行区。由于上行区的气泡向上流动,带动着液体从下往上运动,并在顶部与气体分离后再沿下行区往下,如此循环往复。有时上行区和下行区可以分别是一个容器,两者通过底部和顶部的管道相连,这样的气升式反应器称为外循环的气升式反应器。与搅拌罐相比,气升式反应器增加了促进流体循环的装置,从而大大改善了相间混合与接触条件,有利于传质和反应过程,具有结构简单(内部没有运动部件) 。不需搅拌、节省能量、氧传质效率高、不易污染、剪切力小、安装维修方便等优点,特别适合于对剪切力敏感的微生物细胞[ 38 ] 。Bonnarme等[ 39 ]在7 L (工作体积为5 L)的气升式反应器中实现了L iP和MnP的分别培养,在培养液中Mn ( II)较低浓度515 ×10- 9mol/L 时,可以合成LiP,而在培养液中Mn ( II)浓度高达212 ×10- 7mol/L时则合成MnP。在开始的12 h内,气体的体积流量对影响菌丝球的形状至为关键。体积流量0126～0128 L /L时效果最佳:太高时导致过量泡沫,太低会形成一些大的菌丝团块而不利于传质传氧,并且酶的合成量很少。培养50 h后MnP的酶活性在低锰条件下出现,但从未超过130 U /L。L iP的酶活性在培养70 h后出现,并且稳步上升至140h的760 U /L。MnP在高锰条件下培养50 h时出现(此时LiP未被检测到) ,其酶活性增至94 h时的950 U /L。由此可见,Mn ( II)可以有效地调节L iP和MnP的合成。Gerin等[ 40 ]比较了由气体搅动的气升式反应器、鼓泡式反应器和有螺旋桨搅动的搅拌式反应器后发现,气体搅动比机械搅动更有利木质素降解酶的合成,气升式反应器。鼓泡式反应器中LiP酶活性的最大值分别达4500 U /L、3140 U /L,MnP酶活性最大值分别达1944 U /L、1146 U /L,而搅拌式反应器中LiP酶活性仅为516 U /L,MnP酶活性最大值仅为618 U /L。这是因为机械搅动影响了木质素降解酶的分泌和稳定。综上所述,尽管各种反应器都有其自身优点,但因气升式反应器结构简单、氧传质效率高、剪切力小等优点,也就更适合白腐真菌产酶效率的提高[ 41 ] 。

　　5　结　语

　　白腐真菌酶系对底物有很强的非特异性氧化能力,因此具有广泛的用途[ 42, 43 ] 。但白腐真菌酶系在自然界中的产率很低。目前国内外就如何优化反应器提高其产酶效率的研究尚无定论,反应器的设计不仅要考虑传质传氧、检测调控、运行维修等反应器自身的一般特性[ 44, 45 ] ,还要考虑菌体好氧产酶以及酶易受剪切力破坏等特殊要求[ 46 ] 。因此更深入系统地对反应器进行实验研究,掌握各种反应器的动力学参数和反应器模型才能使之设计更趋完善。酶应用的前提条件是大规模发酵获得酶,然而目前尚没有大规模发酵木质素降解酶的报道。因此如果能把反应器放大,使白腐真菌酶系得以大规模工业化生产应用,则必将有广阔的应用前景[ 47, 48 ] 。

　　参考文献

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